Mikroskopas kuria trimačius gyvų ląstelių filmus

Pagrindinis biologų tikslas yra suprasti taisykles, kurios valdo ląstelės viduje vykstančius molekulinius procesus. „Jei kas nors nori suprasti žaidimo taisykles, tai geriau turėti filmuką su žaidimą žaidžiančiais žmonėmis, o ne nuotraukas su nejudančiais vaizdais“, - pasakė grupės vadovas Erikas Betzigas (Eric Betzig). Jis kuria ir tobulina mikroskopus daugiau kaip trisdešimt metų. Nežiūrint to fakto, kad mikroskopijos metodai per šį laikotarpį stipriai pažengė į priekį, pasak Betzigo, tyrimams trukdo tai, kad daugelyje metodų, naudojamų mikroskopuose, ląsteles reikia nužudyti ir užfiksuoti jų padėtis, norint gauti vaizdą. Nedaug ką galima pasakyti iš mirusių ląstelių analizės. Tai yra tas pats, kaip ir nejudančių nuotraukų nagrinėjimas.

Betzigas norėjo sukurti mikroskopą, kuris leistų mokslininkams pamatyti vidinį gyvos ląstelės gyveninmą. Gyvų ląstelių tyrimai, naudojant fluorescentiškai pažymėtus baltymus bei kitas molekules, nėra naujas dalykas. Bet taikant šiuos metodus gyvoms ląstelėms atsiranda problemų, kadangi mikroskopų kuriama šviesa gali jas laikui bėgant pažeisti. Ląstelės yra ne tik pažeidžiamos. Mikroskopų šviesa veikia fluorescentines molekules, kurių nėra daug ir jos po truputį blėsta. „Kitais žodžiais tariant, kuo ilgiau jūs tiriate molekulę, tuo didesnę ir nepataisomą žalą jai padarote ir išnaudojate savo fotonų rezervą“, - pasakė Betzigas.

Dar daugiau, mikroskopo šviesa apšviečia daug didesnę sritį, nei yra nagrinėjama. Apšvietus nenagrinėjamas sritis, nukenčia tiriamo vaizdo kokybė. „Pagrindinis klausimas buvo, ar galima sumažinti daromos žalos dydį, kad tyrimą būtų galima vykdyti ilgą laiką bei gauti didelės erdvinės ir laikinės skiriamosios gebos vaizdus“, - dėstė Betzigas.

Dar prieš pradėdamas dirbti institute 2006 metais Betzigas pradėjo galvoti apie gyvų ląstelių mikroskopijos patobulinimo būdus. Šias mintis teko atidėti kuriam laikui ieškant metodų, kurie leistų patobulinti difrakcijos dėsnio apribotą mikroskopų skiriamąją gebą. Iki šiol mikroskopai galėjo matyti objektus ne mažesnius nei du šimtai nanometrų dydžio. Prieš keletą metų Betzigas su kolega Haraldu Hesu (Harald Hess) sukūrė mikroskopą (angl. photoactivated localization microscopy), kuris leido stebėti objektus nuo dešimties iki dvidešimties nanometrų dydžio.

Daugelis mikroskopų, tame tarpe ir tie, kuriuos studentai naudoja savo užsiėmimų metu, veikia apšvietus pavyzdėlį bei surenkant vaizdą per tą patį objektyvo lęšį. Tokiame metode naudojama šviesa pažeidžia pavyzdėlį bei sukuria neryškius vaizdus, kurie trukdo matyti gyvas ląsteles.

2008 metais Betzigas pradėjo tyrimus siekdamas pašalinti problemas, trukdančias gyvų ląstelių stebėjimui. Jis planavo panaudoti plokščiojo apšvietimo mikroskopiją (angl. plane illumination microscopy). Metodas buvo pasiūlytas daugiau kaip šimtą metų atgal. Metodo esmė yra tame, kad šviesa apšviečia pavyzdėlį iš šono, o ne iš viršaus. Tam naudojami du vienas kitam statmeni objektyvo lęšiai. Taip pat reikėjo sugalvoti būdą, kaip sumažinti naudojamos šviesos pluoštelį, kad efektyviai būtų apšviesta tik viena ląstelė, kuri yra kelių dešimčių mikronų dydžio. Per didelis šviesos pluoštelis sukuria neryškius gaunamo vaizdo kontūrus. Kad apeiti šią problemą, mokslininkų grupė panaudojo Beselio spinduliuotę, tai yra specialios rūšies difrakcija nepasižymintį šviesos pluoštelį, fizikų nagrinėtą 1980 metais ir dabar naudojamą supermarketų barkodo skeneriuose.

Nors Beselio spinduliuotė ir sukuria labai siaurą šviesos pluoštelį, tačiau apie pagrindinį tašką formuojasi iš abiejų pusių ir silpnesnio intensyvumo šviesos taškai, primenantys jaučio akį. Papildomas apšvietimas sužadina nenagrinėjamas pavyzdėlio sritis ir todėl vaizdas darosi neryškus. Siekdami panaikinti gaunamo vaizdo miglotumą, Beselio spinduliuotė buvo greitai junginėjama, lyg kulkosvaidis apšaudantis taikinį. Mokslininkų grupė savo tyrime taip pat pritaikė dviejų fotonų mikroskopiją. Šis metodas naudojamas tiriant smegenų audinius. Derinant šiuos du metodus buvo gautas ryškus vaizdas iš pagrindinės Beselio spinduliuotės apšviečiamos srities.

Naujajame mikroskope Beselio spinduliuotė leidžia gauti apie du šimtus vaizdų per sekundę. Trimatis vaizdas sukuriamas sujungus šimtus dvimačių vaizdų į vieną. Trimatis vaizdas gaunamas nepadarius žalos ląstelei. Mikroskopu pavyko nufilmuoti ląstelės viduje vykstančius procesus, tokius kaip mitozė, kai dalijantis chromosomoms ląstelė skyla į dvi ląsteles. „Nėra nė vieno kito metodo, kuris galėtų susilyginti su mūsų sukurtu pagal objekto stebėjimo ilgumą bei erdvinę ir laikinę skiriamąją gebą“, - sakė Betzigas.