CRISPR genų redagavimui būtinas išjungimo mygtukas buvo mums po nosimi: atradimas atveria neišpasakytas galimybes ir tuo pačiu – grėsmes

Yra technologija, galinti padėti išspręsti aktualiausias problemas, nuo ligų iki maisto trūkumo. Ja galima ištaisyti tokias ligas, kaip cistinė fibrozė ir pjautuvinė anemija, paprasčiausiai pataisius genetinio kodo gabalėlį, ar išnaikinti maliariją, padarius maliarinius uodus nevaisingais. Būtų galima išnaikinti derlių naikinančius kenkėjus. Ir būtų galima modifikuoti kitus organizmus, taip padidinant jų naudingumą, ir sukuriant skanesnį ir maistingesnį maistą.

Visa tai žada CRISPR, genų redagavimo revoliucijos avangardo įrankis. Natūraliai gaminamas bakterijų, per dešimtmetį nuo jo nepaprasto potencialo atradimo, tarp mokslininkų įgijo žvaigždės statusą, ir jau ima savo pažadus vykdyti. But kur yra šviesa, ten ir šešėlių esama. O ką, jei genų redagavimas nepavyksta? O jei pasireikš nepageidaujami efektai? O jei nesugebėsime jo sustabdyti? Neturint CRISPR kontrolės priemonių ir negalint jo veikimo sustabdyti, genų redagavimo pasekmės gali būti katastrofiškos – tiek žmonių sveikatai, tiek ir visai planetai.

Mums reikia jungiklio, kurį galėtume bet kada panaudoti. Tyrėjai visame pasaulyje ne vienus metus tokio jungiklio ieškojo, daugiausiai, nagrinėdami įvairius biocheminius sprendimus.

Bet, pasirodo, atsakymas gali būti tiesiai po nosimi. Evoliucinėje kovoje tarp CRISPR gaminančių bakterijų ir jas užkrečiančių virusų, gamta anti-CRISPR jau sukūrė. Dabar belieka pasinaudoti šiuo jungikliu savo tikslais ir paspartinti genų redagavimo žadamą aukso amžių.

Virusai, tokie, kaip sukeliantys covid-19, gresia ne vien žmonėms – jie atakuoja visus gyvus organizmus, neišskiriant ir bakterijų. Nuo amžių amžinųjų vykstančioje bakterijų ir virusų kovoje, CRISPR yra vienas iš bakterijoms išsivysčiusių ginklų, kuriais kovoja su jas puolančiais virusais – bakteriofagais (žr. „Evoliucinės ginklavimosi varžybos“).

CRISPR yra daugelio bakterijų genomuose. Tai pasikartojančios DNR atkarpų sekos, tarp kurių įsiterpę buvusių virusų atakų palikti genetinio kodo fragmentai. Fagui vėl bandant įsibrauti į bakteriją, ji pagamina šių CRISPR regionų RNR kopijas. Tuomet šie genetinės medžiagos fragmentai prisijungia prie tam tikro baltymo, – Cas fermento. Jie prisikabina prie atitinkamos sekos įsiveržusio viruso genome, ir Cas baltymas perkerpa DNR giją, sunaikindamas neprašytą virusą. Iš esmės, CRISPR veikia kaip savotiška atmintis apie buvusis virusus, konsultuojanti imunitetą prieš būsimas jų atakas.

Elegantiškas redagavimas

Neverta stebėtis, kad tokia paprasta ir elegantiška sistema paskatino panaudoti CRISPR kaip genų redagavimo įrankį. Šis atradimas pernai laimėjo Nobelio premiją biochemikei Jennifer Doudna iš Kalifornijos universiteto Berklyje ir Emmanuelle Charpentier, dabar vadovaujančiai Max Planck instituto Patogenų mokslo padaliniui. 2012 metais publikuotame tyrime, jos pristatė CRISPR sistemą, kurioje buvo jų pasirinktos, o ne fagų genų sekos, drauge su Cas fermentu, vadinamu Cas9. Šiuo įrankiu biologai gali nusitaikyti į konkrečią DNR seką ir tikslioje vietoje ją perkirpti. Taip galima išjungti norimą geną, arba iškirpti pažeistą ir pakeisti veikiančia jo versija.

Nuo tada CRISPR-Cas9 sistema daug kartų sėkmingai naudota laboratorijose genetiniam ląstelių modifikavimui. Bet norint sukurti efektyvią terapiją, ją reikia pristatyti tiesiogiai į organizmo ląsteles arba fiziškai, pavyzdžiui, injekcija, arba vektoriumi, įprastai – genetiškai redaguotu virusu su norimais genais. 2020 metais mokslininkų komanda JAV pirmą kartą pasiekė šį tikslą, įšvirkšdama CRISPR į ligonio, kurio aklumą lemia vieno geno mutacija, akis. Tačiau tiksliai nusitaikyti į kitas kūno dalis sudėtingiau. Kyla problema, kaip nugabenti CRISPR tik į tas ląsteles, kurias reikia, ir dar užtikrinti, kad jose įvyks pakankamai redagavimo, kad įvyktų norimi pokyčiai. Naudojant vektorius „nėra „stebuklingos kulkos“ – tai labiau primena kulkosvaidį“, sako molekulinis biologas Erik Sontheimer iš Massachusettso universiteto medicinos mokyklos. Būtent tada ima rastis nerimas.

Daug mokslininkų neramina nekontroliuojamo genų redagavimo pasekmės. „Cas9 veikimas netinkamoje vietoje ar pernelyg ilgai, gali būti labai pavojingas,“ sako mikrobiologas Alanas Davidsonas iš Toronto universiteto Kanadoje. Pagrindinė problema – CRISPR gali nusitaikyti į sekas, kurios panašios į ieškomą, tačiau nėra tokios pačios, o Cas9 gali tokias sekas iškirpti. Taip kyla grėsmė, gydant genetines ligas, CRISPR-Cas9 įrankiu atlikti pokyčius kitose žmogaus genomo vietose – vadinamą netikslinį redagavimą.

Be medicininio naudojimo, ne menkesnį nerimą kelia nekontroliuojamas genų redagavimas. CRISPR-Cas9 galima panaudoti genų stūmimui (gene drive), redagavimu padidinant jų tikimybę būti perduotiems kitai kartai ir taip suteikiant pranašumą populiacijoje.

Genų stūmimas gali būti panaudotas puikiems tikslams, tarkime, naikinant tokias ligas, kaip maliarija, stumiant uodų patinų nevaisingumą skatinantį geną ar užkertantį galimybę patelėms kąsti. Bet kyla grėsmė, kad tokie genetiškai pakeisti organizmai gali nekontroliuojamai pasklisti aplinkoje, sukeldami nenumatytas pasekmes.

Kontrolės atsiėmimas

Aiškiai reikia kruopštesnės CRISPR-Cas9 kontrolės. Čia ir pasirodo anti-CRISPR. CRISPR rastas pusėje ištirtų bakterijų genomų. Tačiau kai kurie bakteriofagai sukūrė nuosavas pasipriešinimo sistemas.

Jų apsauga – genomuose užkoduoti maži baltymai, vadinami anti-CRISPRs (Acrs). Bakteriją užkrėtęs fagas suleidžia savo genetinę medžiagą ir tuomet pajungia ląstelės mašineriją jau savo genų kopijų gamybai. Acr genai išreiškiami vieni iš pirmųjų, tad anti-CRISPR gali iš karto imtis blokuoti bakterijos CRISPR atsaką. Acr naudoja įvairius mechanizmus, tarpo kurių tiesioginis prisijungimas prie Cas fermento, neleidžiantis CRISPR-Cas prisijungti prie DNR.

Anti-CRISPR buvo netyčia atrastas 2012 metais, prasidedant CRISPR genų redagavimo revoliucijai. Dirbdamas Davidsono laboratorijoje, mikrobiologas Joseph Bondy-Denomy nustebo pamatęs, kad fagų, užkrėtusių pneumoniją sukeliančias bakterijas, mikrobų CRISPR sistema nesunaikina. Įsigilinęs jis atrado, kad viruse yra bakterijos gynybą deaktyvuojančių genų. Iš pradžių Bondy-Denomy savo atradimo svarbos nesuprato. Tuomet niekam nerūpėjo CRISPR-Cas9 kontrolės problema, nekalbant jau apie būdus ją įgyvendinti. Kaip bebūtų, jis toliau tyrinėjo Arcs, ir aptiko juos įvairiuose kituose faguose. Kurį laiką ši sritis domino tik jį ir jo kolegas.

2016 metais Bondy-Denomy su kolegomis išsiaiškino, kad Acr gali deaktyvuoti Cas9 fermentą, kuris naudojamas didžiojoje daugumoje genų redagavimo tyrimų. Tuomet jis jau turėjo savo laboratoriją Kalifornijos universiteto, San Franciske. Buvusi jo kolegė April Pawluk atrado tą patį baltymą AcrIIA4. Tuomet dėmesį atkreipė ir CRISPR tyrinėtojai. Kadangi kontrolės problema jau buvo plačiai pripažįstama, jie ėmėsi anti-CRISPR tyrimo. Per kelis mėnesius komanda, kurioje dalyvavo ir Doudna, į žmogaus ląsteles kartu su CRISPR-Cas9 pristatė ir AcrIIA4, taip apribodami geno redagavimo laiką ir minimzuodami netikslinio redagavimo problemą. Laiko nustatymas su Acr suteikė dar vieną kontrolės sluoksnį, ir buvo galima Cas9 išjungti staiga ar pamažu.

Apie Acr baltymus dar reikia daug ką išsiaiškinti, tačiau jų galimybė reguliuoti genų redagavimą aiški. „Labai džiugu galvoti apie šią Acr strategiją kaip apie vieną iš galimybių – ar netgi svarbiausią galimybę,“ sako Bondy-Denomy. „Ji suteikia galimybę turėti genetinį jungiklį, įkoduotą kartu su Cas9.“

Tai suteikia svarbų pranašumą, lyginant su kitais būdais. Visų pirma, taip pacientams reikia patirti mažiau terapijų, nei naudojant atskirą Cas9 veikimą stabdantį vaistą. Be to, šiuo atveju Cas9 ir AcrIIA4 garantuotai būna toje pačioje vietoje tuo pačiu metu. Ir dar įgaunama didesnė geno redagavimo pradžios ir sustabdymo kontrolė, įjungiant ir išjungian t du baltymus – naudojant, pavyzdžiui, šviesą. Be to, viena grupė sukūrė AcrIIA4 versiją, kuri gali būti įjungiama ir išjungiama, ją apšvietus, ši technika vadinama optogenetika.

Į taikinį

Anti-CRISPR netgi galėtų padėti išspręsti genų redagavimo apribojimo tik tam tikrose ląstelėse problemą. Reguliuojant Acr, įmanoma sukurti CRISPR-Cas9-Acr kompleksus, kurie niekados neveiktų organizmo dalyse, kurios nėra jų taikinys. Sontheimerio komanda pademonstravo tai pirmuoju sėkmingu anti-CRISPR tyrimu gyvame organizme. Tyrėjai sukūrė Acr, kuris buvo aktyvus tik jeigu šalia buvo RNR atkarpa, esanti tik kepenų ląstelėje. Tuomet jie pridėjo jį prie CRISPR-Cas9, tad genų redagavimas vyko tik pelės kepenyse. Tokį būdą būtų galima panaudoti bet kuriame organe, turinčiame unikalią RNR molekulę.

„Mums būtina kontroliuoti genų redagavimą – čia ir praverčia anti-CRISPR“

Acr kombinavimas su CRISPR turi ir ilgalaikių pranašumų. Dabar CRISPR-Cas9 genus į ląsteles dažniausiai nugabena virusai, bet tuomet jie lieka ten neapibrėžtai ilgai, nes inkorporuojami į ląstelės DNR. Dėl to lieka rizika, kad Cas9 kada nors kaip nors vėl suaktyvės ir nepageidaujamai pakeis genomą. Tam galima užkirsti kelią, jei genų redagavimo sekoje yra išjungimo mygtukas.

Anti-CRISPR pažanga buvo įspūdingai sparti, tačiau neatsakytų klausimų tebelieka. Vienas iš jų – ar saugu Acr naudoti žmonėms. „Nemanau, kad jie kelia kokią nors grėsmę, kokios sukeltų CRISPR, ar, tiesą sakant, bet kokių pašalinių baltymų naudojimas žmonėms,“ sako Davidsonas. Kaip bebūtų, tiek Acr, tiek ir CRISPR-Cas9 kilmė nėra žmogiška, tad gali sukelti imuninį atsaką, kuris juos deaktyvuotų ir galėtų sukelti žalojantį uždegimą. Jau užfiksuota, kad Cas9 sukuria antikūnus pelėms. Tačiau Acr yra maždaug 100 kartų mažesni už Cas9, tad mažesnis pavojus, kad imuninė sistema apsipažins. Bondy-Denomy nemano, kad pridėjus Acr, reikalai kaip nors pablogės.

Didžiausias iššūkis bus priversti anti-CRISPR veikti praktiškai. Norint kontroliuoti genų redagavimą, naudojant Acr, reikia sugalvoti, kaip nugabenti juos į reikiamą kūno vietą ir patikimai juos ten kontroliuoti. To atlikti dar negalime. „Vis dar tik krapštome paviršių,“ sako Davidsonas. Tai neturėtų stebinti, atsimenant, kad pačiai idėjai vos keli metai. Bondy-Denomy tiki, kad vieną dieną tai vyks. Bet norint įgyvendinti gyvybę gelbstintį CRISPR potencialą, tokio pat susidomėjimo ir tyrimo kūrybiškumo lygio turi sulaukti ir anti-CRISPR. „Išties svarbu, kad tai atsidurtų visų radaruose,“ sako Bondy-Denomy.

Evoliucinės ginklavimosi varžybos

Išsivystęs genialus bakterijų gynimosi nuo virusų mechanizmas – CRISPR – susideda iš dviejų elementų: DNR atkarpos, galinčios atpažinti virusus, su kuriais bakterijai teko susidurti, ir įsibrovėlį galinčio sukapoti fermento. Šis CRISPR gebėjimas aptikti ir sunaikinti patraukė genų redagavimą siekiančių sukurti mokslininkų dėmesį (žr. pagr. pasakojimą). Tačiau gamtoje CRISPR galia, panašu, nyksta. Kai kuriems bakterijas užkrečiantiems virusams išsivystė baltyminis ginklas, vadinamas anti-CRISPR – ir jis beveik visada apsaugo virusą.

Tai šiokia tokia evoliucinė mįslė, kodėl atranka išlaiko CRISPR bakterijose, sulaukiančiose anti-CRISPR pasipriešinimo. Vienas iš galimų paaiškinimų – CRISPR įgijo kokių nors kitų naudingų funkcijų. Pavyzdžiui, jis kai kurioms bakterijoms padeda formuoti bioplėveles – įvairių mikrobų bendrijas, suteikiančias daug išgyvenimo pranašumų jų nariams. Be to, kai kurios bakterijos CRISPR reguliuoja savo genų ekspresiją. Ši sistema gali turėti ir kitų, dar neatrastų panaudojimo būdų.

Kita priežastis bakterijoms išlaikyti CRISPR – tam tikromis aplinkybėmis, tai vis dar efektyvi priemonė prieš anti-CRISPR turinčius virusus. Svarbiausias faktorius, panašu, viruso ir bakterijų populiacijų dydžių santykis. CRISPR sistemos veikimui reikia energijos, bet didelis jos privalumas – greitas atsakas. Tad, kai bakterijas atakuoja vos keli virusai, CRISPR gali jų atsikratyti jiems nespėjus pasidauginti ir aktyvuoti savo anti-CRISPR, tad mikrobams nereikia švaistyti pernelyg daug energijos.

Nesibaigiantis mūšis

Kol bakterijoms išsivystė CRISPR, tikriausiai praėjo tūkstančiai metų. „Tam reikia didžiulių genetinių inovacijų,“ sako Edze Westra iš Exeterio universiteto, JK, studijuojantis bakterijų imuniteto evoliucinę biologiją. Visgi, evoliucinė jo ateitis nėra aiški. Tegalime būti užtikrinti, kad išgyvenimo ginklavimosi varžybose bakterijos ir toliau vystys inovatyvią gynybą nuo virusų, o virusai vystys puolimo būdus.