Į dešimtuką: nauja greitos genetinės inžinerijos era

Genų sekoskaita (sekvenavimas) tapo paprasta. Genų supratimas tebelieka neįtikėtinai sunki užduotis. Kai sekoskaitos duomenų srovelė tapo šniokščiančiu srautu, mūsų žinios nespėja pavymui. Vis dar labai mažai suprantame, ką, jei išvis ką nors, veikia mūsų DNR.

Tai nėra problema, kurią galėtų išspręsti kompiuteriai. Galiausiai tėra vienas būdas sužinoti, ką veikia tam tikra DNR dalis – reikia pakeisti ją tikroje, gyvoje ląstelėje ir pažiūrėti, kas vyksta. Bet genų inžinerija labai sudėtingas ir brangus užsiėmimas.

Bent jau toks buvo. Praeitą mėnesį dvi grupės pranešė apie stulbinančius pasiekimus. Jos nusitaikė ir išjungė beveik visus lėkštelėje auginamų ląstelių genus. Savaime suprantama, jie neišjungė visų ląstelės genų išsyk, bet po vieną. Tai yra, po vieną modifikavo 20 000 genų. „Tai išties nuostabu,“ sako Ericas Landeris, MIT ir Harvardo Broado instituto direktorius, vadovavęs vienam iš tyrimų. „Tai yra tikra transformacija.“

Palyginimui, 2007 m. buvo pradėtas tarptautinis projektas, siekęs „išjungti“ kiekvieną iš 20 000 pelės genų. Buvo dedamos daugelio pasaulio laboratorijų bendros pastangos, trukusios ilgiau, nei penkis metus ir kainavusios 100 mln. dolerių. Dabar dvi komandos atliko kažką panašaus atskirai, panaudodamos mažą dalį laiko ir pinigų. To paslaptis – naujas paprastas ir galingas genomų keitimo būdas. Taip, žodis „proveržis“ banalus ir nuvalkiotas, bet šiuo atveju jo panaudojimo tikslingumas abejonių nekelia. „Tai keičia žaidimo taisykles,“ sako Feng Zhang, taip pat iš Broado instituto, vadovavęs kitam tyrimui.

Vos prieš metus atrasta technika, kelia didžiulį susijaudinimą, kai aiškėja jos potencialas. Ji jau ima spartinti tyrimus – pavyzdžiui, Landeris ir Zhang naudojo ją išsiaiškinti, kurie genai skatina vėžio atsparumą vaistams. Ateityje ji tikriausiai bus naudojama genų terapijoje ir naujų genetiškai modifikuotų organizmų kūrimui, plačiai, tačiau tikslai pakeičiant jų genomus. Ir jei kada nuspręstume genetiškai modifikuoti žmones, tai čia yra įrankis tam atlikti.

Nors genų inžinieriai jau yra atlikę nuostabių dalykų, jų pirmieji įrankiai buvo labai grubūs. Jie bombarduodavo ląstele papildoma DNR – kartais tiesiogine šio žodžio prasme – tikėdamiesi, kad jis atsitiktinai prisijungs prie ląstelės genomo. Tačiau nebuvo jokio būdo sukontroliuoti, į kurią genomo vietą ji, o jei pakliuvusi į netinkamą vietą, ji gali sukelti sumaištį. Be to, toks būdas neleisdavo niekaip reguliuoti esančių genų, o tai yra pagrindinis būdas išsiaiškinti, ką genai ir jų variantai veikia.

Taigi, pastaruosius porą dešimtmečių dėmesys buvo nukreiptas į genomo keitimą. Įsivaizduokite genomą kaip receptų kolekciją, prižiūrimą aklų bibliotekininkų ir surašytą ant ilgų popieriaus juostų. Bibliotekininkai stengiasi ištaisyti bet kokius juostos pažeidimus, bet kadangi negali skaityti, juos lengva apgauti.

Jeigu juosta perpjaunamas per recepto vidurį, bibliotekininkai sujungs dalis, tačiau tai darydami, jie dažnai receptą sugadina. Kitaip tariant, geną galima išjungti, jį perpjaunant.

Negana to, jei pridėsite papildomą popieriaus gabaliuką ir tada perpjausite juostą, bibliotekininkai dažniausiai nutaria, kad tai buvo atpjauta nuo ritinio ir pridės ten, kur padarytas pjūvis. Taip galima DNR segmentus pridurti tiksliai ten, kur norite.

Taigi, genomo keitimo paslaptis yra perpjauti DNR reikiamoje vietoje ir leisti ląstelės DNR taisymo mechanizmui atlikti visą darbą už jus. Praktikoje tai reiškia radimą molekulės, kuri, atsidūrusi ląstelėje, prisijungtų prie konkrečios DNR sekos ir tame taške ją perpjautų. Yra būtent tai darančių natūralių baltymų, bet tikimybė rasti egzistuojantį baltymą, kuris visame genome nusitaikytų į konkrečią jus dominančią sritį, yra nykstamai maža.

Tad, kiekvienam pakeitimui turi būti kuriami, gaminami ir išbandomi dirbtiniai baltymai, prisijungiantys prie konkrečios DNR sekos. Tai įmanoma ir tai daro daug tyrimų laboratorijų visame pasaulyje. Išties, toks genų keitimo būdas greitai gali būti pradėtas naudoti genų terapijoje, gydant viską – nuo pjautuvinės anemijos iki ŽIV. Tačiau nors ir yra visokių triukų, paspartinančių prie konkrečių DNR vietų prisitvirtinančių dirbtinių baltymų kūrimą, tai vis vien toli gražu nėra paprasta. Darant pačiam, tai gali užtrukti mėnesius ar metus arba kainuoti dešimtis tūkstančių dolerių, jei tą darbą pavesite atlikti kam kitam. Lyg to dar būtų maža, didžioji dalis technologijos yra patentuota.

Tačiau dabar yra daug greitesnė, pigesnė ir – kol kas – laisvai visiems prieinama alternatyva. Jos atsiradimo istorija prasideda XX a. devintojo dešimtmečio antroje pusėje. Tyrinėdama E. coli bakterijos genomą, Japonijos mokslininkų grupėpastebėjo įneįprastą pasikartojančių sekų seriją, atskirtą, regis, atsitiktinių DNR gabaliukų, kurie vėliau pavadinti „tarpikliai“. Šios charakteringos pasikartojančių atkarpų ir tarpiklių sekos dabar žinomos kaip reguliariai atskirtų trumpų palindromų pasikartojimai (angl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats – CRISPR (tariama „krisper").

Pasirodė, kad CRISPR labai paplitę. Jų yra pusėje visų bakterijų ir 90 procentų archėjų. Tai reiškia, kad jie turi dsaryti kažką neįtikėtinai naudingo. Bet ką? Jų tikslas liko neaiškus iki 2005 m., kai trys grupės paskelbė, kad atrodančios atsitiktinės tarpiklio DNR atkarpos iš tiesų atitiko paprastas ląsteles atakuojančių virusų DNR.

Tokiems biologams, kaip Eugene'as Kooninas iš Nacionalinio sveikatos instituto Bethesda'oje, Marylande, tai iškart nurodė tikslą: gal šie tarpikliai atitinka „ieškomas“ plakatų serijas, leidžiančias ląstelėms atpažinti ir sunaikinti virusų DNR. Kitaip tariant, tai imuninė sistema.

Iki 2009 m. tolesni tyrimai patvirtino spėjimus ir taipogi parodė, kaip sistema veikia. Procesas prasideda, kai iš tarpiklio ir jo pasikartojimų pagaminama RNR kopija. Ši RNR susijungia su CRISPR asociuotu, kitaip – Cas, baltymu. RNR suteikia smegenis, o Cas baltymas – raumenis: RNR prisijungia ląstelėje prie bet kurio atitinkamo viruso DNR, o Cas baltymas jį supjausto.

Be to, supjaustyti virusinės DNR gabaliukai kartais įjungiami CRISPR regioną ir suformuoja naujus tarpiklius. Taip ieškomųjų plakatai išlieka švieži, nors virusai savo išvaizdą ir keičia. Mokymasis, kaip kovoti su su virusais yra kažkas, ką daro gyvūnų imuninė sistema, tačiau niekada nemanyta, kad tai gali daryti ir paprastos ląstelės. „Mano žiniomis, CRISPR-Cas yra pirmoji ir vienintelė adaptyvi archėjų ir bakterijų imuninė sistema,“ sako Emmanuelle Charpentier iš Umeå universiteto Švedijoje.

Tiesą sakant, vienu atžvilgiu ši sistema geresnė už mūsiškę, nes imunitetas gali būti perduodamas būsimoms kartoms. Kaip pažymėjo Kooninas 2009 m., CRISPR sistemą galima laikyti lamarkinės evoliucijos forma – prisitaikymas, įgytas per individo gyvenimą, perduodamas jo palikuoniams.

Bet tai jau kita istorija. Kas keletą genetikų labai sujaudino, tai faktas, kad taikymosi į DNR procese dalyvauja RNR, o ne baltymas. „CRISPR-Cas yra patrauklus, nes remiasi kitu DNR atpažinimo būdu,“ pastebi Jennifer Doudna iš Kalifornijos universiteto, Berkeley'yje. Ar gali ši paprasta sistema būti panaudota genų keitimui?

Nepaprastai galingas

Pirmieji darbai nuvylė, nes DNR pjaustantis Cas baltymas pasirodė esantis sudėtingas, susidedantis iš keleto kitų baltymų, ir dirbti su jais būtų nelengva. Tada, 2011 m., Charpentiero komanda padarė svarbų atradimą. Jie tyrė dažnai žmones užkrečiančių bakterijų, Streptococcus pyogenes CRISPR-Cas sistemą. Jie atrado, kad ji smarkiai skyrėsi nuo kitų sistemų. „Vietoje baltymų komplekso, jie naudojo vos vieną baltymą,“ sako Charpentieris.

Sistema buvo sudėtingesnė kitur – jai reikėjo ne vieno, bet dviejų RNR nuvairuoti DNR pjaustantį baltymą, dabar vadinamą Cas9, į paskirties vietą. Tačiau 2012 m. Charpentieris ir Doudna kartu parodė, kad tos dvi RNR gali būti sudurtos į vieną dirbtinę RNR molekulę, taip pat sėkmingai valdančią Cas9 baltymą.

Tai, ką jie sukūrė buvo potencialiai labai paprastas, bet labai galingas genomo keitimo įrankis. Kadangi RNR molekulė užsiima nutaikymu, nereikia kurti tai atliekančių baltymų. Tyrėjams tereikia sukurti RNR, kurioje būtų 20 bazių porų seka, atitinkanti nusitaikytą DNR, o taip pat įprastas sekas, reikalingas RNR susikabinimui su Cas9 baltymu. „Tai daug paprastesnis taikymosi būdas,“ sako Doudna.

Svarbiausia, norimų RNR gaminimas yra nepalyginamai greitesnis ir pigesnis už baltymų kūrimą. Automatizuotos mašinos gali paruošti trumpas DNR ar RNR su bet kokia norima seka per valandas ir tai atsieina tik kelis dolerius.

Bet Charpentierio ir Doudna'os tyrime buvo taikomasi į DNR gabaliukus, laisvai plaukiojančius mėgintuvėlyje. Ar bakterinė sistema veikia sudėtingose gyvūnų ir augalų ląstelėse? Doudna'os komanda pasirengė tai patikrinti, bet juos aplenkė Zhango ir George Churcho iš Harvardo universiteto komandos, kurios abi pirmąją 2013-ųjų savaitę paskelbė, kad CRISPR-Cas9 sistema puikiausiai veikia ir žmogaus ląstelėse (Science, vol 339, p 819 ir p 823). Tai buvo gyvybiškai svarbu, sako Doudna, kurios tyrimas pasirodė vos trimis savaitėmis vėliau .

Po to visi panūdo išbandyti CRISPR-Cas9. „Tai buvo sprogimas ir toliau juda labai greitai,“ sako Charlesas Gersbachas iš Duke universiteto Durhame, Šiaurės Karolinoje. „Tai liudija, kaip lengva juo naudotis ir koks tai galingas įrankis.“

Jau parodyta, kad CRISPR-Cas9 sistema veikia daugybėje organizmų rūšių, tarp kurių pelės, Danio rerio žuvytės ir vaisinės muselės. Ji taip pat veikia augaluose, įkaitant ryžius ir kviečius, – plačiausiai auginamas grūdines kultūras. Niekas dar neatliko CRISPR sistemos palyginimo su kitomis genomo keitimo metodais, tad, dar nėra aišku, kuri yra tikslesnė tik taikinio DNR paveikimo atžvilgiu ir efektyvesnė, skaičiuojant sėkmingai pakeistų ląstelių procentą. Bet jau vien įvertinus greitį ir ir naudojimo paprastumą, CRISPR laimi be klausimų.

Ir tai ne vieninteliai pranašumai: kadangi sistema vystėsi taikytis į daugelį virusų, ji gali būti panaudota daugiau negu vieno geno modifikavimui ląstelėje iš karto. „Bakterijose CRISPR sistema jau yra daugiatikslė, taigi, kai pirmą kartą apie tai sužinojau, pirma į galvą šovusi mintis buvo apie daugiatikslę,“ sako Zhang.

Jis parodė, kad vienu metu galima keisti bent jau penkis genus (Cell, vol 153, p 910). „Privačiai žmonės man sakė, kad tuo pat metu modifikavo daug daugiau genų,“ priduria jis. Kitomis technikomis daugybinius genų pakeitimus atlikti daug sudėtingiau. Churchas sukūrė „evoliucijos mašiną“ potencialiai galinčią atlikti tūkstančius ląstelių pakeitimų (New Scientist, 27 June 2011, p 34), bet ji sudėtinga ir kol kas veikia tik su bakterijomis.

Kam reikia iškart modifikuoti tiek genų? „Paimkime su ligomis siejamas mutacijas,“ aiškina Zhang. „Niekada nebūna taip, kad diabetą ar širdies problemas sukeltų vienintelė mutacija – visada būna kombinacija.“ Norint ištirti jų poveikį, reikia sukurti ląstelių linijas ar gyvūnus, turinčias šias kombinacijas.

Tai reikšdavo kelių pelių linijų sukūrimą, kurių kiekviena turėdavo vieną modifikaciją, tada praleisti metus kryžminant jas, kad būtų išvesta linija, turinti visas modifikacijas

Dabar tai galima atlikti vienu žingsniu – naudojant CRISPR sistemą atlikti daugybinius pelės embriono pakeitimus, kol ji dar yra vienos ląstelės stadijoje.

Kas trukdavo porą metų ar ilgiau, dabar gali būti atlikta per šešias savaites, palygina Zhang. „Tai didelis skirtumas.“ Praleidusiems metus, stengiantis padaryti vieną ar du specifinius augalų ar gyvūnų pakeitimus, tai yra revoliucija.

Pasidaryk savo vaistus

Ir lyg to dar nepakaktų, tai dar ne viskas, ką gali atlikti CRISPR sistema. Genų aktyvumą kontroliuoja baltymai, vadinamieji transkripcijos faktoriai. Šie baltymai atpažįsta ir prisitvirtina prie specifinių DNR sekų šalia geno ir, stiprindami ar silpnindami DNR į informacinę RNR transkribuojančių fermentų aktyvumą, padidina geno aktyvumą arba jį išjungia. Sukūrus savo transkripcijos faktorius, galima kontroliuoti genų aktyvumą – tokia galimybė turi visokiausių panaudojimo būdų tyrimuose ir medicinoje. Bet kol kas daugeliui bandymų reikėdavo naujų baltymų sukūrimo, kas, kaip jau matėme, nėra paprasta.

Gersbach ir keletas kitų suvokė, kad Cas9 baltymą galima modifikuoti taip, kad užuot karpęs DNR, jis veiktų kaip transkripcijos faktorius. Liepą jo komanda įrodė, kad tai veikia žmonių ląstelėse (Nature Methods, vol 10, p 973).

Tai atveria daugybę galimybių. Pavyzdžiui, toks būdas galėtų būti panaudotas gydant autoimunines ligas, tokias, kaip artritas, pasiekus, kad ląstelės žmogaus kūne gamintų daugiau specifinio priešuždegiminio baltymo. „Užuot davę baltymą kaip vaistą, galėtume paskatinti ląsteles gaminti jį pačioms,“ sako Gersbachas.

Tačiau dar teks įveikti daug kliūčių, kol CRISPR sistema galės būti panaudota žmonių gydymui. Vienas iš didžiausių klausimų yra pristatymas. „Kaip tai įdėti į tinkamas kūno ląsteles tinkamu metu?“ klausia Zhang.

O ten, kur CRISPR naudojamas DNR karpymui, reikia panaikinti perkirpimo neteisingoje vietoje riziką. Tam tikru lygiu tai vyksta su visais metodais – biologija yra painus dalykėlis, – bet CRISPR gali būti šiuo atžvilgiu itin pažeidžiama, nes sistema vystėsi, kovodama su nuolat kintančiais virusais.

Bet šioje srityje netrūksta užtikrintumo. „Reikia atminti, kad dar tebeina pirmieji vystymo panaudojimui žmonių ląstelėse metai,“ sako Gersbachas. „Žinoma, ateityje metodas dar bus tobulinamas. Tebedirbame su CRISPR 1.0. versija“

Colin Barras

New Scientist № 2953