RNR molekulių cheminių modifikacijų tyrimai kamieninėse ląstelėse atskleis naujas smegenų vėžio gydymo galimybes

Remiantis Europos vėžio informacine sistema ECIS, kasmet nustatomi 7,5-13 centrinės nervų sistemos (CNS) navikų atvejų 100 tūkst. gyventojų. Kai tuo tarpu Lietuvos vėžio registro duomenimis, Lietuvoje kasmet užregistruojama 270-330 naujų piktybinių CNS navikų atvejų. Apie 30 proc. visų smegenų ir CNS navikų sudaro gliomos. Lietuvoje, kaip ir visame pasaulyje, sergamumas šia onkologine liga nuosekliai didėja [1,2].

Dėl gliomoms būdingo ląstelių heterogeniškumo bei jautrių ankstyvos diagnostikos metodų trūkumo, net ir taikant optimizuotą gydymą (chirurginis naviko šalinimas, radioterapija, chemoterapija), sergančiųjų piktybiškiausia gliomos forma - glioblastoma (GBM, 4 piktybiškumo laipsnis pagal Pasaulinės sveikatos organizacijos klasifikaciją) prognozė išlieka bloga. Tokių pacientų vidutinis išgyvenamumas po diagnozės siekia vos 12-15 mėnesių [3]. Trumpa išgyvenamumo trukmė po diagnozės ir aukštas pacientų mirtingumas, sergant galvos smegenų navikais, skatina ieškoti naujų ankstyvos diagnostikos ir gydymo metodų. Tam pasitelkiami naujausi mokslo atradimai molekulinės biologijos srityje – tiek ligos diagnostikai, tiek ir gydymui taikomos specifinės molekulės.

Nustatyta, kad bloga sergančiųjų GBM prognozė bei naviko ataugimas yra susiję su gliomos kamieninių ląstelių (GKL) populiacijomis, kurios aptinkamos auglyje. Šio tipo ląstelės yra susijusios su naviko augimu, išplitimu į kitus audinius bei atsparumu gydymui [13,14]. Pritaikant molekulines žinias apie ląstelėse vykstančius vėžėjimo procesus, kurie leistų tikslingai parinkti gydymo metodus, nukreiptus būtent į GKL, būtų galima pasiekti geresnių rezultatų glioblastomų gydyme. Deja, šiai dienai tokio įrankio nėra sukurta. Todėl atliekamos įvairios studijos, kurių metu tyrinėjamos GKL populiacijos, jų genetinės ir morfologinės savybės, siekiant išsiaiškinti galimus taikinius ar mechanizmus, kurie būtų panaudoti sėkmingam GBM gydymui.

RNR molekulės gali būti modifikuojamos uždedant chemines žymes ir taip pakeičiant auglio savybes

Dar 1990 m. startavus “Žmogaus genomo projektui” buvo tikimasi, kad iššifruota žmogaus deoksiribonukleorūgščių (DNR) seka bei genų visuma atskleis įvairių ligų, taip pat ir vėžio, vystymosi mechanizmus ir reikšmingai prisidės prie jų gydymo pažangos. Deja, paaiškėjo, kad DNR seka yra tik viena iš labai sudėtingos vystymosi dėlionės dalių. Dėl to, jau kelis dešimtmečius moksliniai tyrimai, susiję su vėžio biologija, yra orientuojami ne tik į baltymus ir juos koduojančius genus, bet ir į ribonukleorūgščių (RNR) molekules. Per pastaruosius 30 metų nustatyta nemažai skirtingų RNR tipų, kurie skiriasi savo dydžiu, struktūra ir atliekamomis funkcijomis ląstelėje [17].

Paaiškėjo, kad apie 70 proc. žmogaus genomo sudaro nekoduojančios RNR (nkRNR) molekulės. Šioms molekulėms yra būdinga tai, kad jos nekoduoja baltymų, tačiau lemia jų gamybą bei skaidymą [15]. Viena iš nkRNR grupių yra ilgosios nekoduojančios RNR (inkRNR) molekulės. Jos gali reguliuoti daugelio genų veiklą ląstelėje, todėl vaidina svarbų vaidmenį įvairiuose biologiniuose procesuose, tokiuose kaip ląstelių vystymasis, metabolizmas, migracija ar mirtis [4]. Neseniai parodyta, jog inkRNR yra susijusios su įvairių auglių, įskaitant ir gliomas, vystymusi [5,6].

Nustatyta, jog inkRNR molekulių, kurios koduoja vėžio atsiradimą įtakojančius SNHG16 arba CRNDE genus, raiškos lygis yra reikšmingai padidėjęs žmogaus gliomos ląstelių linijose, lyginant su sveiko žmogaus galvos smegenų ląstelėmis - astrocitais [7]. Tuo tarpu vėžinių kamieninių ląstelių atsinaujinimą skatinanti inkRNR HOTAIR yra aptinkama gliomos kamieninėse ląstelėse, o šių molekulių vis daugiau randama piktybėjant gliomos navikui [16]. Tad manoma, jog inkRNR galėtų būti specifiškai susijusios su vėžio vystymusi, o jų reguliavimo mechanizmų išaiškinimas atvertų galimybes kurti efektyvias vėžio terapijos, prevencijos bei ankstyvosios diagnostikos strategijas. Galimai, cheminės žymės ant inkRNR reguliuoja šių molekulių raiškos pokyčius.

Naujausios žmogaus transkriptomo studijos parodė, kad koduojančių ir nekoduojančių RNR molekulių grandinės gali būti chemiškai modifikuojamos. Šiuos procesus tyrinėja mokslas – epitranskriptomika. Iš viso RNR molekulėse aptinkama daugiau nei šimtas skirtingų modifikacijų, iš kurių labiausiai iki šiol tyrinėtos yra m6A, m7G, m1A, Ψ, m6Am ir 5mC. RNR modifikacijos gali keisti jų stabilumą, lokalizaciją, fermentinį aktyvumą bei sąveikas su kitomis molekulėmis (DNR, RNR ir baltymais). Be to, daugėja įrodymų, kad RNR modifikacijos yra ypatingai svarbios įvairiuose mūsų organizmuose vykstančiuose biologiniuose procesuose, taip pat ir patologijos, vėžinių susirgimų atvejais [8].

Viena labiausiai paplitusių RNR modifikacijų yra RNR azotinės bazės adenino  metilinimas (N6-metiladenozinas, m6A). Visai neseniai buvo nustatyta, kad ši cheminė modifikacija RNR molekulėse lemia pačių molekulių skaidymą, transportavimą, stabilumą ir skilimą bei reguliuoja ląstelių dauginimąsi, plitimą, kamieninių ląstelių diferenciaciją bei vėžio biocheminių procesų pusiausvyrą. Šiai dienai jau nustatyti RNR molekulių m6A modifikacijų pokyčiai kepenų, krūties, plaučių vėžio bei GBM vystymosi metu [9]. Tai rodo, jog m6A cheminės modifikacijos yra svarbios  vėžio vystymesi ir gali apspręsti jo savybes.

Dar viena plačiai šiuo metu tyrinėjama cheminė modifikacija - citozino metilinimas RNR molekulėje (5mC). Inovatyvių metodų dėka dabar yra žinoma, kad 5mC yra plačiai paplitusi daugialąsčių organizmų transkriptome [10,11]. Panašiai kaip ir kitos modifikacijos, 5mC keičia RNR aktyvumą bei dalyvauja kamieninių ląstelių funkcijų reguliavime. Be to, ženkliai sumažėjęs 5mC modifikacijų lygis aptinkamas melanomos, krūties bei šlapimo pūslės vėžio atvejais [12]. Deja, išsamus m5C reguliavimas RNR molekulėse kitų vėžinių susirgimų atveju, įskaitant GBM, išlieka menkai suprantamas ir ištirtas.

Taigi, supratimas apie biologinį skirtingų cheminių RNR modifikacijų poveikį organizmams pradeda formuotis, tačiau dar labai daug apie tai yra nežinoma. Tačiau jau šiandien neabejojama, kad ne tik koduojančios, bet ir nekoduojančios RNR molekulės yra susijusios su vėžio vystymosi ir progresavimo procesais, o tai leidžia manyti, jog šios molekulės gali būti labai geri molekuliniai žymenys, kurie padėtų apibūdinti auglio savybes, nuspėti ligos eigą ir atsaką į gydymą. Todėl nkRNR modifikacijų analizė vėžinėse ląstelėse, įskaitant vėžines kamienines ląsteles, kurios susijusios su naviko vystymusi, progresavimu ir atsparumu terapijai, padeda įvertinti epitranskriptomo modifikacijų reikšmę vėžiniuose susirgimuose ir galimybę tas modifikacijas keisti, taip keičiant ir paties auglio savybes. Tai leidžia kurti efektyvesnes terapines priemones. Tad tolimesni šios krypties moksliniai tyrimai greitu metu neabejotinai atsakys į daugelį su vėžio, tame tarpe glioblastomų, vystymųsi ir gydymu susijusių klausimų.

LSMU NI Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje tiriamas gliomos kamieninių ląstelių epitranskriptomas

Siekiant gauti daugiau žinių šioje srityje, Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Neuromokslų instituto  (LSMU NI) Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos komanda šiuo metu vykdo Lietuvos mokslo tarybos (LMT) finansuojamą nacionalinės mokslo programos „Sveikas senėjimas“ projektą „Gliomoms specifinių ilgų nekoduojančių RNR epitranskriptomo žymenų paieška gliomos kamieninėse ląstelėse ir navikuose“ (Projekto nr. S-SEN-20-7), vadovė dr. D.Skiriutė. Projekte bendradarbiaujama su LSMU NI Molekulinės neurobiologijos laboratorija (vadovė dr. P. Vaitkienė), kurioje tiriamos nkRNR modifikacijos smegenų patologijų atveju, taip pat dr. B. Rotblato grupe iš Izraelio (BenGuriono universitetas), kurie turi didelę patirtį tyrimuose su glioblastomų gyvūnų modeliais, tiria nkRNR molekules gliomos kamieninėse ląstelėse, užaugintose panaudojant ksenograftus (pelių modelius). Taip pat bendradarbiavimas RNR molekulių naujos kartos sekoskaitos srityje vyksta su dr.  K. Almstrup grupės mokslininkais iš Kopenhagos universiteto (Danija).

Projekto metu planuojama įvertinti nkRNR epitranskriptomines modifikacijas gliomos kamieninėse ląstelėse ir gliomos augliuose, siekiant nustatyti potencialius gliomų patogenezės ir progresavimo molekulinius žymenis, kurie būtų reikšmingai susiję su pacientų klinikinėmis charakteristikomis, atsaku į terapiją ir išgyvenamumu. Tikslui įgyvendinti bus taikomos pažangios MeRIP-seq ir Nanopore sekoskaitos technologijos, kurių pagalba bus išanalizuotos pagrindinės cheminės modifikacijos (m6A ir 5mC) nkRNR molekulėse bei įvertintos jų sąsajos su gliomos kamieninių bei vėžinių ląstelių savybėmis. Sėkmingai įgyvendinus projektą, bus sudarytas nkRNR su būdingomis epitranskriptomo modifikacijomis rinkinys, kuris galėtų būti potencialus gliomų patogenezės ir progresavimo rodiklis bei pasitarnautų klinikinėje praktikoje kuriant naujus glioblastomos gydymo metodus, nukreiptus į gliomos kamienines ląsteles.

Pirminiais projekto duomenimis, bendradarbiaujant su dr. P. Vaitkienės bei dr. K. Almstrup komandomis, buvo pritaikyta Nanopore sekoskaitos technologija ir išanalizuotas glioblastomos (U87 MG) ir gliomų kamieninių ląstelių (NCH421K) m6A modifikacijos lygis RNR molekulėse. Palyginus dvi ląstelių linijas tarpusavyje, rasta 31 inkRNR molekulė, kurių raiška bei m6A modifikacijų lygis labai stipriai skyrėsi. Pateiktame paveiksle matyti, kaip šių inkRNR molekulių raiška pasiskirsčiusi abiejose ląstelių linijose (rausva spalva – inkRNR raiška padidėjusi, melsva – sumažėjusi). Taip pat paveiksle galima matyti kaip stipriai inkRNR raiška skiriasi lyginant U87 MG ir NCH421K ląstelių linijas (geltona spalva – didelis skirtumas, mėlyna – mažas skirtumas). Didžiausiu raiškų skirtumu pasižyminčiose inkRNR aptinkami ryškiausi m6A modifikacijų pokyčiai, todėl daroma prielaida, jog būtent šios inkRNR molekulės yra susijusios su gliomagenezės procesais.

Literatūros sąrašas

1. Europe Cancer Information System. Brain tumor statistics. Prieiga [https://ec.europa.eu/info/statistics_eu].
2. Nacionalinis Vėžio Institutas. Vėžio registras. Prieiga [https://www.nvi.lt/vezio-registras/].
3. Chao F, Li D, Zhang X, Liu N, Chi G, Jin X.  LncRNA PVT1 Facilitates Tumorigenesis and Progression of Glioma via Regulation of MiR-128-3p/GREM1 Axis and BMP Signaling Pathway. Neurotherapeutics, 2018; 15:1139–1157. doi: 10.1007/s13311-018-0649-9.
4. Chan J J, and Tay Y. Noncoding RNA:RNA Regulatory Networks in Cancer. Int J Mol Sci, 2018; 19(5):1310. doi: 10.3390/ijms19051310.
5. Li Z, Xu C, Ding B, Gao M, Wei X, Ji N. Long non-coding RNA MALAT1 promotes proliferation and suppresses apoptosis of glioma cells through derepressing Rap1B by sponging miR-101. J Neurooncol, 2017; 134(1):19-28. doi: 10.1007/s11060-017-2498-5.
6. Lu Y F, Cai X L, Li Z Z, Lv J, Xiang Y A, Chen J J, Chen W J, Sun W Y, Liu X M, Chen J B. LncRNA SNHG16 Functions as an Oncogene by Sponging MiR-4518 and Up- Regulating PRMT5 Expression in Glioma. Cell Physiol Biochem, 2018; 45(5):1975-1985. doi: 10.1159/000487974.
7. Frank J S,  Arul M C. The Role of Non-coding RNAs in Oncology. Cell, 2019; 179(5):1033-1055. doi: 10.1016/j.cell.2019.10.017.
8. Nombela P,  Miguel-López B, Blanco S. The role of m6A, m5C and Ψ RNA modifications in cancer: Novel therapeutic opportunities. Molecular Cancer, 2021; 20(1):18. doi: 10.1186/s12943-020-01263-w.
9. Shuiping L, Qiujie L, Ke C, Zhang Q, Li G, Zhuo L, Zhai B, Sui X, Hu X, Xie T. The emerging molecular mechanism of m6A modulators in tumorigenesis and cancer progression. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2020; 127:110098. doi: 10.1016/j.biopha.2020.110098.
10. Frye M, Blanco S. Post-transcriptional modifications in development and stem cells. Development, 2016; 143, 3871-3881. doi:10.1242/dev.136556.
11. Visvanathan A, Patil V, Abdulla S, Hoheisel J D, Somasundaram K. N6-Methyladenosine Landscape of Glioma Stem-Like Cells: METTL3 Is Essential for the Expression of Actively Transcribed Genes and Sustenance of the Oncogenic Signaling. Genes, 2019; 10(2):141. doi:10.3390/genes10020141.
12. Xu T, Gao H. Hydroxymethylation and tumors: can 5-hydroxymethylation be used as a marker for tumor diagnosis and treatment? Human Genomics, 2020; 14(1):15. doi: 10.1186/s40246-020-00265-5.
13. Sundar S J, Hsieh J K, Manjila S, Lathia J D, Sloan A. The role of cancer stem cells in glioblastoma. Neurosurg Focus, 2014; 37(6):E6. doi: 10.3171/2014.9.FOCUS14494.
14. Kawamura Y, Takouda J, Yoshimoto K, Nakashima K. New aspects of glioblastoma multiforme revealed by similarities between neural and glioblastoma stem cells. Cell Biol Toxicol. 2018; 34(6):425–440. doi: 10.1007/s10565-017-9420-y.
15. Dinescu S, Ignat S, Lazar A D, Constantin C, Neagu M, Costache M. Epitranscriptomic Signatures in lncRNAs and Their Possible Roles in Cancer. Genes, 2019; 10(1):52. doi:10.3390/genes10010052.
16. Christian T S, Yancey G G, Willey C D. Exploring the Roles of lncRNAs in GBM Pathophysiology and Their Therapeutic Potential. Cells, 2020; 9(11):2369. doi:10. 3390/cells9112369.
17. PCAWG Transcriptome Core Group. Genomic basis for RNA alterations in cancer. Nature, 2020; 578:129–136. doi:10.1038/s41586-020-1970-0.

Šaltinis: Molekulinės Neuroonkologijos laboratorija, Neuromokslų Institutas, Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas